Autoanticorpi

Microphotographs of indirect immunofluorescence of specific antibodies in Hep2 cells
(a) Cytoplasmic P-ribosomal pattern. (b) NuMA-1 pattern. (c) Centromeric or discrete speckled pattern. (d) SSA discrete speckled pattern. (e) Homogeneous pattern. (f) Nucleolar with mitochondrial pattern.

Copyright © 2014 Soto et al. “Predictive value of antinuclear antibodies in autoimmune diseases classified by clinical criteria: Analytical study in a specialized health institute, one year follow-up.” Results in immunology (CC BY 3.0)

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Anticorpi anti-nucleo e anti-ENA

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Introduzione

Il termine “anticorpi anti-nucleo” (ANA) indica anticorpi che, quando rilevati mediante immunofluorescenza indiretta su cellule HEp-2 (cellule epiteliali di carcinoma della laringe umana), riconoscono almeno 30 distinti antigeni, tra cui componenti di:

• Nucleo
• Membrana nucleare
• Apparato mitotico
• Citoplasma
• Organelli citoplasmatici
• Membrana cellulare

Nb. Il termine “anti-nucleo” non è, quindi, tecnicamente corretto, ma il suo utilizzo è ormai consolidato.

Sono soprattutto IgG, ma possono appartenere a qualsiasi classe.

La concentrazione anticorpale viene valutata mediante diluizioni successive (fino alla scomparsa della fluorescenza) e indicata come titolo. Un titolo < 1:80 è considerato negativo; un titolo compreso tra 1:80 e 1:160 è considerato debolmente positivo (a basso titolo); un titolo > 1:160 è considerato positivo (ad alto titolo).  

L’immunofluorescenza indiretta (IFI) su cellule HEp-2 è tuttora considerata la tecnica gold standard per la determinazione di questi anticorpi. Recentemente, sono state sviluppate tecnologie automatizzate per l’acquisizione e la valutazione del pattern fluoroscopico.

Per la valutazione della specificità antigenica degli ANA vengono utilizzate tecniche immunometriche (soprattutto ELISA), che hanno specificità elevata ma sensibilità ridotta.  

In genere, quindi, in seguito alla positività degli ANA all’IFI e in presenza di un quadro clinico suggestivo di patologia autoimmune, viene eseguito un test immunometrico per la determinazione della specificità antigenica. 

I bersagli antigenici degli ANA sono:

• Anti-ssDNA (aspecifici e con scarsa rilevanza clinica)
• Anti-dsDNA
• Anti-cromatina/nucleosoma
• Anti-Sm
• Anti-P robosomiali
• Anti-istone
• Anti-Ro/SSA e anti-La/SSB
• Anti-Scl70
• Anti-RNA polimerasi I e III
• Anti-centromero
• Anti-RNP
• Anti-Jo1
• Anti-antigeni citoplasmatici (es. anti-mitocondri)
• etc.

Il termine ENA (Extractable Nuclear Antigen) si riferiva originariamente ad antigeni di natura proteica estraibili dal nucleo cellulare in soluzione fisiologica. Oggi il termine indica, in maniera più ampia, vari antigeni intracellulari specifici verso cui sono rivolti gli ANA.
La ricerca degli anticorpi anti-ENA viene effettuata in presenza di ANA ad alto titolo e con ANA assenti o a basso titolo qualora il quadro clinico sia suggestivo (soprattutto per la ricerca di anti-Ro/SSA, anti-Jo1 e anti-P ribosomiali, dal momento che l’IFI può dare falsi negativi).
Esistono pannelli di esami orientati in base al sospetto clinico e/o al pattern fluoroscopico e esami CLIA o FEIA in grado, con un unico test, di rilevare numerosi anticorpi specifici.

Condizioni associate

Gli ANA hanno bassa specificità. Vengono riscontrati in pazienti con:

• Connettivite mista (100% dei soggetti)
• Lupus eritematoso sistemico (95%)
• Lupus farmaco-indotto (95%)
• Lupus eritematoso cutaneo acuto e subacuto (90%)
• Sclerosi sistemica (90%)
• Sindrome di Sjögren (80%)
• Miopatie infiammatorie idiopatiche (50-60%)
• Sindrome da anticorpi antifosfolipidi
• Cirrosi biliare primitiva
• Tiroidite autoimmune
• Artrite reumatoide
• Policondrite ricorrente
• etc.

ANA a basso titolo possono essere rilevati anche in:

• Infezioni (tubercolosi, endocardite batterica, infezione da EBV, etc.)
• Neoplasie
• Soggetti in trattamento con alcuni farmaci (procainamide, idralazina, isoniazide, penicillamina, anticonvulsivanti, clorpromazina, metildopa, anti-TNFα)
• Soggetti anziani
• Soggetti sani

La positività degli ANA, quindi, non indica necessariamente la presenza di una malattia autoimmune né, viceversa, la negatività la può escludere.

Il titolo degli ANA non correla con l’attività di malattia.

Pattern fluoroscopico

Il pattern fluoroscopico è suggestivo – a grandi linee – dell’antigene bersaglio. È possibile rilevare più di 30 diversi pattern fluoroscopici, di cui meno della metà è considerato, attualmente, di rilevanza clinica.

I principali pattern fluoroscopici sono:

• Nucleare:
  • Omogeneo → dsDNA, istoni, cromatina/nucleosomi (lupus eritematoso sistemico, lupus farmaco-indotto)
  • Granulare grossolano (coarse speckled) → U1RNP (connettivite mista), Sm (lupus eritematoso sistemico), RNA polimerasi III (sclerosi sistemica diffusa)
  • Granulare sottile (fine speckled) → Ro/SSA e La/SSB (sindrome di Sjögren), Mi2 (dermatomiosite)
  • Centromerico → CENP-A, CENP-B, CENP-C (sclerosi sistemica limitata / sindrome CREST)
  • Nucleolare:
    • Scl70/DNA-topoisomerasi I, U3RNP/fibrillarina, RNA polimerasi I (sclerosi sistemica diffusa)
    • To/Th (sclerosi sistemica limitata)
    • PM/Scl (sindrome overlap sclerosi sistemica/polimiosite)
  • Membrana nucleare:
    • Omogeneo (laminine A, B1, B2, C, LAP1A, LAP2)
    • Punteggiato (gp120, proteine del complesso del poro nucleare)
  • Nuclear dots (Sp100)
• Citoplasmatico:
  • Omogeneo → P ribosomiali (lupus eritematoso sistemico)
  • Granulare → Jo1 (polimiosite)
  • Fibrillare/citoscheletrico (actina, vimentina, citocheratina, tropomiosina, vinculina, etc.)
  • Apparato di Golgi
  • Lisosomi
  • etc.
• Apparato mitotico (centrosoma/centriolo, fuso mitotico, etc.): tubulina, enolasi, NuMA, etc.

Specificità antigeniche

Anticorpi specifici del lupus eritematoso

Anti-dsDNA

Titoli elevati di anticorpi anti-dsDNA (double-stranded DNA, DNA a doppio filamento) sono altamente specifici per il lupus eritematoso sistemico e il titolo correla con l’attività di malattia: aumenta nelle fasi attive e scompare o si riduce nelle fasi di remissione e si associa in modo particolare con l’interessamento renale. La sensibilità infatti è del 90% nella malattia attiva con interessamento renale, del 60% nella malattia attiva senza interessamento renale e < 30% in fase non attiva.

Vengono quindi utilizzati sia nella diagnosi che nel follow-up.

Gli anti-dsDNA possono essere ricercati mediante CLIFT o tecniche immunometriche (CLIA, FEIA, ELISA, etc.).
Il CLIFT (Crithidia luciliae immunofluorescence test) è un metodo altamente specifico ma poco sensibile; viceversa, i metodi immunometrici di ultima generazione sono sensibili, ma la specificità è inferiore rispetto alla CLIFT (per cui è opportuno che i risultati positivi ottenuti con metodi immunometrici siano confermati con il CLIFT).

Nella fase di monitoraggio, la determinazione quantitativa degli anticorpi anti-dsDNA deve essere eseguita esclusivamente con metodologie immunometriche e sempre con lo stesso metodo. 

Anti-cromatina/nucleosoma

Gli anticorpi anti-cromatina/nucleosomi sono specifici per il lupus eritematoso sistemico, positivi nel 60-70% dei soggetti, soprattutto quelli negativi per gli anti-dsDNA.

Il loro titolo correla con l’attività di malattia.

Anti-Sm (Smith)

Smith è un complesso macromolecolare costituito da almeno 8 diversi polipeptidi, che rappresentano il sito di legame dell’RNA messaggero allo spliceosoma.

Anticorpi anti-Sm sono altamente specifici per il lupus eritematoso sistemico (> 95%), ma poco sensibili (10-20% dei pazienti).

Anti-P ribosomiali

Gli anti-P ribosomiali sono altamente specifici per il lupus eritematoso sistemico, ma sono poco sensibili (presenti solo nel 10-25% dei soggetti affetti).

Si associano soprattutto al lupus neuropsichiatrico (in particolare manifestazioni psicotiche).

Anti-istone

Possono formarsi autoanticorpi rivolti contro i singoli istoni (H1, H2A, H2B, H3, e H4) e contro i complessi H2A-2B e H3-4.

Gli anti-istone, soprattutto gli anti-H2A/2B, sono molto specifici per il lupus farmaco-indotto e sono presenti in oltre il 95% dei soggetti.

Gli anticorpi anti-istone possono essere riscontrati anche nei pazienti con:

• Lupus eritematoso sistemico (50-60%)
• Artrite reumatoide
• Sindrome di Felty
• Connettivite indifferenziata
• Cirrosi biliare primitiva
• etc.

Anti-Ro/SSA e anti-La/SSB

Anticorpi anti-Ro/SSA e anti-La/SSB sono presenti rispettivamente nell’80% e nel 50% circa dei pazienti con sindrome di Sjögren.

Possono essere positivi solo gli anti-Ro/SSA o entrambi (gli anti-La/SSB da soli sono invece molto rari).

Gli anti-Ro/SSA si associano anche a:

• Lupus neonatale (gli anti-Ro/SSA attraversano la barriera placentare e possono provocare lupus neonatale, la cui complicanza più temibile è il blocco cardiaco congenito)
• Lupus eritematoso cutaneo subacuto (fino al 90% dei soggetti)
• Lupus eritematoso sistemico (30% circa dei soggetti)

Anticorpi specifici della sclerosi sistemica

Anti-Scl70 / topo1 (DNA topoisomerasi I)

Gli anti-DNA topoisomerasi I sono altamente specifici per la sclerosi sistemica diffusa (> 95%), ma con una sensibilità variabile dal 30 al 40% circa.

Il titolo correla con l’estensione del coinvolgimento cutaneo e con l’attività globale della malattia.

La presenza di anti-Scl70 sembra associarsi ad un aumentato rischio di fibrosi polmonare e coinvolgimento cardiaco. La positività degli anti-Scl70 è un fattore prognostico negativo.

Il monitoraggio del titolo anticorpale può essere utile per monitorare la risposta alla terapia.

Anti-RNA polimerasi I e III

Gli anti-RNA polimerasi I e III sono poco sensibili (10-20% dei pazienti) ma altamente specifici per sclerosi sistemica diffusa e si associano in particolare con un interessamento cutaneo esteso e con le crisi renali sclerodermiche. Spesso costituiscono un fattore prognostico negativo.

Il test necessario per la loro ricerca è complesso, non è disponibile in tutti i laboratori e non viene utilizzato di routine a scopo diagnostico.

Anti-centromero

Gli anticorpi anti-centromero sono rivolti contro le proteine centromeriche CENP-A, CENP-B, CENP-C, etc.

Gli anti-CENP B sono specifici per la sclerosi sistemica limitata, ma presenti solo nel 30-40% dei pazienti, in particolare quelli con ipertensione polmonare o sindrome CREST.

Possono essere riscontrati anche in una ridotta percentuale di pazienti con sclerosi sistemica diffusa, sindrome di Sjögren e patologie neoplastiche.

Anti-RNP

Le SnRNP sono piccole proteine nucleari RNA-associate che costituiscono la maggior parte del complesso proteico dello spliceosoma.

Le principali sono rappresentate dalle proteine U1RNP (chiamata anche nRNP), U2RNP, U4/U6RNP e U5RNP, le quali comprendono ciascuna più polipeptidi e 5 piccoli RNA nucleari (snRNA) ricchi di uridina (URNA).

Gli anticorpi anti-RNP possono essere riscontrati in numerose malattie autoimmuni, quali il lupus eritematoso sistemico, l’artrite reumatoide, la sclerosi sistemica e la sindrome di Sjögren.

Anti-U1RNP ad alto titolo hanno sensibilità e specificità per connettivite mista > 95%.

Anti-Jo1

Gli anti-Jo1 sono rivolti contro l’istidil-tRNA sintetasi.

Sono altamente specifici per la polimiosite (>95%), ma poco sensibili (25-30% circa).

Anticorpi anti-fosfolipidi

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Gli anticorpi antifosfolipidi (aPL) sono una famiglia eterogenea di autoanticorpi che riconoscono fosfolipidi, fosfolipidi legati a proteine e proteine ad alta affinità per i lipidi:

• Cardiolipina
• β₂-glicoproteina I (β2GPI, chiamata anche apolipoproteina H)
• Protrombina
• Annessina V
• Proteina S
• Proteina C
• Fosfatidilserina
• Fosfatidilinositolo
• Fosfatidiletanolamina
• Complesso fosfatidilserina/protrombina
• Complesso cardiolipina/vimentina
• etc.

Gli aPL sono presenti sia nella sindrome da anticorpi antifosfolipidi che in altre condizioni:

• Connettiviti:
  • Lupus eritematoso sistemico (20% circa dei soggetti)
  • Sindrome di Sjögren
  • Sclerosi sistemica
  • Malattia mista del connettivo
  • Dermatomiosite
• Artrite reumatoide (30%)
• Artrite psoriasica
• Polimialgia reumatica
• Arterite gigantocellulare
• Malattia di Behçet
• Porpora trombotica trombocitopenica
• Malattie infettive (sifilide, borreliosi, leptospirosi, epatite C, infezione da HIV, malaria)
• Alcune terapie farmacologiche (clorpromazina, fenitoina, procainamide, propranololo, etc.)

Gli aPL sono presenti anche in una percentuale variabile dall’1 al 5% della popolazione sana.

Il meccanismo che porta alla formazione di questi autoanticorpi non è noto.

Dal punto di vista patogenetico, svolgono un ruolo diretto nel favorire la trombosi, inducendo (direttamente o indirettamente):

• Attivazione delle cellule endoteliali con produzione di citochine pro-infiammatorie, molecole di adesione cellulare, endotelina-1 e fattore tissutale
• Attivazione piastrinica, aumentata espressione di GpIIb–IIIa, aumentata sintesi di trombossano A2 e secrezione di PF4 (fattore piastrinico 4)
• Attivazione del complemento con formazione di prodotti di degradazione chemiotattici per cellule infiammatorie
• Induzione di un fenotipo procoagulante nei monociti, con aumentata espressione di fattore tissutale
• Inibizione della proteina C

Questi elementi favoriscono, nel complesso, un fenotipo proadesivo, proaggregante e procoagulante.
Tuttavia, dal momento che solo una minoranza di soggetti con questi anticorpi presenta le manifestazioni cliniche, sono necessari anche altri fattori.
A questo riguardo, è stata suggerita l’ipotesi del doppio insulto: gli aPL (primo insulto) aumentano il rischio di eventi trombotici che avvengono in presenza di un’altra condizione (secondo insulto), tra cui fumo, patologie infiammatorie, infezioni, terapia estroprogestinica, immobilizzazione protratta, obesità, terapie farmacologiche, etc.

La cardiolipina (isolata per la prima volta dal cuore bovino, da cui il nome) è un fosfolipide costituente della membrana interna dei mitocondri presente anche, in minima parte, nella membrana mitocondriale esterna, nella membrana del perossisoma ed espressa sulla superficie delle cellule apoptotiche.
Gli anticorpi anti-cardiolipina (aCL) legano principalmente neoepitopi presenti sulla cardiolipina ossidata. Questi anticorpi mostrano un’associazione statisticamente significativa nei confronti del rischio trombotico solo se presenti ad alto titolo (> 40 GPL; le IgG correlano con le manifestazioni cliniche più delle IgM e delle IgA). aCL a basso titolo possono essere presenti anche in altre condizioni.
Dal momento che il test VDRL (utilizzato nella diagnosi della sifilide) contiene cardiolipina, i soggetti con aCL risultano positivi al test VDRL.

La β2-glicoproteina I (β2GPI, chiamata anche apolipoproteina H) è una glicoproteina con elevata affinità per i fosfolipidi anionici sintetizzata prevalentemente dal fegato e normalmente presente nel plasma (per il 60% legata a lipoproteine e per il 40% in forma libera). È costituita da 5 domini ripetuti, chiamati sushi, e può assumere tre diverse conformazioni (che espongono epitopi diversi).
La funzione precisa della β2GPI non è nota; la proteina sembra in grado di inibire l’attivazione della protrombina e l’aggregazione piastrinica (e di legare il LPS batterico, facilitandone la fagocitosi) e potrebbe essere coinvolta nel processo di apoptosi.
Gli anti-β2GPI sono direttamente coinvolti con la patogenesi delle manifestazioni cliniche della sindrome da anticorpi antifosfolipidi e sono un fattore di rischio indipendente per trombosi e complicanze ostetriche. In particolare, quelli rivolti contro epitopi del dominio I (anti-β2GPI dominio I) sono quelli associati al rischio più elevato.
Gli anti-β2GPI di classe IgG e IgM vengono ricercati mediante test ELISA.

Il ruolo degli altri autoanticorpi non è ancora noto.
Alcuni studi suggeriscono un’associazione tra gli anticorpi rivolti contro la protrombina (aPT) e contro il complesso protrombina/fosfatidilserina (aSP) e il rischio di trombosi, soprattutto venosa.
Altri studi associano la presenza di anti-annessina V ad una maggiore frequenza di complicanze ostetriche.

Test LAC (lupus anticoagulant)

In vitro, gli anticorpi antifosfolipidi interferiscono con l’assemblaggio e l’attivazione dei fattori della coagulazione, prolungando il tempo di coagulazione nei test fosfolipide-dipendenti. Questo fenomeno è stato scoperto per la prima volta in alcuni pazienti con lupus eritematoso sistemico, da cui il nome lupus anticoagulant (successivamente è stato osservato, però, che anche pazienti senza manifestazioni del lupus eritematoso sistemico potevano mostrare positività al lupus anticoagulant; negli anni successivi si è giunti alla scoperta degli anticorpi antifosfolipidi e alla definizione della sindrome da anticorpi antifosfolipidi).

Il test LAC valuta quindi la presenza di anticorpi antifosfolipidi (principalmente anti-β2GPI, anti-protrombina/fosfatidilserina, anti-trombina, anti-annessina V) in grado di prolungare significativamente il tempo di coagulazione nei test fosfolipide-dipendenti, come il test al veleno di vipera Russel diluito (dRVVT) e il tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT). Il prolungamento non deve essere corretto dall’aggiunta di plasma normale (per escludere un deficit dei fattori della coagulazione), mentre viceversa, deve essere corretto dall’aggiunta di fosfolipidi (che saturano gli anticorpi).

Il test deve essere eseguito secondo i criteri proposti dalla International Society on Thrombosis and Haemostasis Scientific Subcommittee (ISTH-SSC).

Il test è consigliato, in associazione alla ricerca degli aCL e degli aβ2GPI, in presenza di alcune condizioni non riconducibili ad altre cause (es. neoplasie), come:

• Tromboembolismo venoso prima dei 50 anni
• Tromboembolismo venoso in sedi atipiche
• Ictus ischemico, TIA o altre sedi di tromboembolismo arterioso prima dei 50 anni
• Trombosi microvascolare
• Tromboembolismo venoso ricorrente
• Patologia della gravidanza (perdita fetale dopo la 10° settimana, aborto ricorrente, pre-eclampsia, etc. (vedere Sindrome da anticorpi antifosfolipidi)
• Lupus eritematoso sistemico

Il test può essere preso in considerazione anche in caso di trombocitopenia autoimmune, livedo reticularis, etc.

Il test non andrebbe eseguito durante un evento tromboembolico acuto, in corso di terapia anticoagulante e in gravidanza.

Anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA)

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Gli ANCA (anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili) sono IgG dirette contro antigeni presenti nei granuli primari dei neutrofili e nei lisosomi dei monociti. Tra questi antigeni, i più importanti sono la mieloperossidasi (MPO) e la proteinasi 3 (PR3).

Produzione degli ANCA

Il meccanismo preciso che porta alla formazione di questi autoanticorpi non è noto. È probabile che siano coinvolti agenti infettivi e fenomeni di mimetismo molecolare e epitope spreading.
Ad esempio, la hLAMP-2 è una glicoproteina lisosomiale di membrana presente nei granuli e sulla membrana dei neutrofili e sulla membrana delle cellule endoteliali che presenta elevata omologia con la proteina FimH dei batteri gram-negativi: l’immunizzazione di ratti con FimH risulta nella produzione di anticorpi ANCA che cross-reagiscono con hLAMP-2 e inducono glomerulonefrite pauci-immune.

Ruolo degli ANCA

Gli ANCA sono direttamente coinvolti nella patogenesi delle vasculiti ANCA-associate.
I neutrofili e i monociti attivati da stimoli infiammatori (ad es. TNFα), esprimono questi antigeni sulla superficie cellulare, rendendoli accessibili agli ANCA. L’interazione degli ANCA con i neutrofili avviene sia tramite il legame del frammento F(ab’)2 con gli antigeni espressi sulla membrana cellulare, sia attraverso il legame del frammento Fc con i recettori FcγRIIa e FcγRIIIb.
Il legame di questi anticorpi amplifica e mantiene nel tempo l’attivazione dei leucociti, favorendo:

• Degranulazione
• Produzione e rilascio di specie reattive dell’ossigeno, citochine, chemochine, enzimi proteolitici e NETs (che possono contenere anche le stesse MPO e PR3)
• Espressione di integrine leucocitarie che aumentano la capacità dei neutrofili di aderire all’endotelio e di danneggiarlo

Nella maggior parte dei casi, la titolazione degli ANCA correla con l’attività della malattia e trattamenti che eliminano gli anticorpi, come la plasmaferesi, sono efficaci nel controllare l’infiammazione e la necrosi vascolare.
La persistenza o la ricomparsa degli ANCA nei pazienti in remissione clinica è associata a recidiva, mentre il rischio è molto basso nei pazienti in cui gli ANCA sono persistentemente negativi.
Sono stati descritti singoli casi in cui il passaggio di ANCA materni al neonato ha determinato lo sviluppo di manifestazioni cliniche transitorie.
Alcuni modelli animali confermano il ruolo patogenetico degli anti-MPO: l’immunizzazione di topi knockout per la MPO con MPO murina e il trasferimento di cellule spleniche in topi Rag2(-/-) determina la produzione di ANCA-MPO e lo sviluppo di glomerulonefrite necrotizzante. Studi successivi su questo modello hanno ulteriormente confermato il ruolo degli anti-MPO nello sviluppo della vasculite, che può essere bloccato o ridotto inducendo una deplezione di neutrofili, TNFα o complemento, confermando il ruolo patogenetico anche di questi elementi.

Tuttavia, alcuni pazienti con vasculiti ANCA-associate sono ANCA-negativi e, nella quasi totalità dei casi, il passaggio transplacentare degli ANCA non determina malattia nel neonato.

L’ipotesi al momento più accreditata è che sia necessaria la contemporanea presenza degli ANCA e di stimoli pro-in

Rilevazione degli ANCA

Le metodiche più utilizzate per la determinazione degli ANCA sono l’immunofluorescenza indiretta (IFI) su neutrofili umani fissati con etanolo e la metodica ELISA per la valutazione delle singole specificità antigeniche.

Immunofluorescenza indiretta e pattern fluoroscopici

L’immunofluorescenza indiretta su neutrofili umani fissati con etanolo (che determina la fuoriuscita degli enzimi dai granuli e la loro redistribuzione nel citoplasma in relazione alle cariche delle diverse molecole) permette di individuare 2 principali quadri fluoroscopici: un pattern citoplasmatico (cANCA) e un pattern perinucleare (pANCA). Accanto ai due pattern principali si possono riconoscere anche quadri atipici o mal definibili (ANCA atipici).
Un’immunofluorescenza positiva deve essere seguita dal test ELISA per la determinazione della specificità antigenica.

pANCA e anti-MPO

Il pattern pANCA (perinucleare) è dovuto principalmente alla mieloperossidasi (MPO) e ad altri enzimi ad attività antimicrobica (elastasi, catepsina G, lattoferrina, lisozima, etc.). Queste molecole, per la loro intensa carica positiva tendono a disporsi in zona perinucleare.

Gli anticorpi anti-MPO presentano una forte associazione con la vasculite e sono rilevabili in presenza di:

• Poliangioite microscopica (60-70% dei pazienti)
• Granulomatosi eosinofila con poliangioite (40-60%)
• Granulomatosi con poliangioite (5-10%)
• Sindrome di Goodpasture (10%)

cANCA e anti-PR3

Il principale antigene associato con il pattern cANCA (citoplasmatico) è la proteinasi 3 (proteasi neutra leucocitaria, PR3), contenuta nei granuli azzurrofili dei neutrofili.

Gli anti-PR3 presentano una forte associazione con la vasculite e vengono riscontrati in:

• Granulomatosi con poliangioite: anti-PR3 sono presenti nel 90% dei pazienti con granulomatosi con poliangioite generalizzata e nel 40-50% dei pazienti con malattia limitata, con una sensibilità e specificità complessive, rispettivamente, del 66% e del 98%. In presenza sia di un pattern citoplasmatico (cANCA all’IFI) sia di anti-PR3 al test ELISA, la specificità aumenta al 99%.
• Poliangioite microscopica (15-30%)
• Granulomatosi eosinofila con poliangioite (5-10%)

ANCA atipico, non-MPO e non-PR3

Mentre gli anti-MPO e gli anti-PR3 sono specifici per le vasculiti ANCA-associate, un pattern ANCA atipico e/o con specificità non-MPO e non-PR3 possono essere riscontrati anche in altre condizioni, tra cui:

• Colangite sclerosante (ANCA atipico 80%)
• Artrite reumatoide (ANCA atipico/pANCA non anti-MPO)
• Lupus eritematoso sistemico (ANCA atipico <20%)
• Rettocolitecolite ulcerosa (ANCA atipico 60%)
• Malattia di Crohn (ANCA atipico < 10%)
• Altre condizioni (tubercolosi, epatiti autoimmuni, neoplasie, etc.)
• Farmaci (propiltiouracile, idralazina, minociclina, etc.); in questo caso gli ANCA presentano un pattern atipico e specificità antigenica eterogenea (MPO, PR3, lattoferrina, elastasi neutrofila, catepsina G, etc.)
• Cocaina: l’abuso di cocaina, soprattutto se adulterata con levamisolo, può indurre la produzione di ANCA, in particolare anti-elastasi (dd con granulomatosi con poliangioite)

Anticorpi anti-peptidi citrullinati (ACPA)

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La citrullinazione è il processo post-traduzionale di conversione dell’arginina in citrullina mediato dall’enzima peptidil-arginina deaminasi (PAD). È un processo fisiologico, importante per regolare struttura, attività e degradazione delle proteine. L’enzima PAD è calcio-dipendente ed è inattivo alle normali concentrazioni intracellulari di calcio, mentre viene attivato da un suo aumento (apoptosi, infiammazione, stress ossidativo, etc.).
Nell’uomo sono presenti 5 isoforme di peptidil-arginina deiminasi (PAD1-PAD4 e PAD6). Questi enzimi sono in grado, nell’umano, di convertire solo residui proteici e non residui amminoacidici liberi.

Anticorpi associati alla citrullinazione sono considerati altamente specifici per artrite reumatoide. Possono riconoscere sia i prodotti della citrullinazione (es. i peptidi citrullinati), sia gli enzimi PADs (es. PAD2 e PAD4).

Gli ACPA (anti–citrullinated protein antibodies) riconoscono peptidi e proteine citrullinati presenti nella sinovia dei soggetti con artrite reumatoide, in particolare:
• Fibrinogeno/fibrina
• Vimentina
• Fibronectina
• α-enolasi
• Collagene II
• etc.

Gli ACPA rappresentano un marker precoce di malattia (possono essere rilevati anche molti anni prima dell’esordio clinico), hanno un elevato valore predittivo positivo per lo sviluppo di erosioni e si associano ad un aumentato rischio di interstiziopatia polmore e coinvolgimento cardiaco.

Gli attuali ACPA-ELISA mostrano sensibilità e specificità rispettivamente dell’80% e del 98%.
La contemporanea positività per FR (fattore reumatoide) e ACPA ha un valore predittivo positivo per artrite reumatoide del 100%.

Il ruolo patogenetico preciso degli ACPA non è noto. Le cellule B isolate dal liquido sinoviale dei pazienti affetti da artrite reumatoide sono in grado di produrre spontaneamente ACPA. Inoltre, mentre i livelli di FR diminuiscono al miglioramento del quadro clinico, i livelli degli ACPA rimangono stabili.

Il fumo aumenta l’espressione dell’enzima PAD4, favorendo la formazione di peptidi citrullinati e l’espressione di epitopi in grado di stimolare la produzione di ACPA. Studi di immunoistochimica effettuati sui lavaggi broncoalveolari e su biopsie bronchiali di soggetti fumatori e non fumatori hanno dimostrato un livello di espressione di PAD2 e una quantità di proteine citrullinate maggiore nei polmoni dei fumatori che in quelli dei non fumatori. I fumatori presentano un rischio aumentato di sviluppare artrite reumatoide.

Recentemente è stata posta molta attenzione sul ruolo del microbiota orale e della parodontite nell’etiopatogenesi dell’artrite reumatoide. In particolare, un batterio comunemente riscontrato nelle tasche gengivali, il Porphyromonas gingivalis, produce una peptidil-arginina deaminasi (chiamata PPAD) in grado di citrullinare specifici peptidi.

Le isoforme PAD2 e PAD4 risultano particolarmente abbondanti nel tessuto sinoviale e nel liquido sinoviale dei soggetti con artrite reumatoide e, oltre a generare autoantigeni citrullinati, possono costituire esse stesse dei bersagli antigenici in alcuni subset di pazienti con artrite reumatoide.

Fattore reumatoide (FR)

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Il fattore reumatoide (FR) è un’immunoglobulina, solitamente IgM, che lega la porzione costante Fc delle IgG, con formazione di immunocomplessi.

Il FR è poco specifico, presente in pazienti con:

• Artrite reumatoide (sensibilità del 50-70% circa; la sua presenza alla diagnosi correla con l’aggressività della malattia)
• Sindrome di Sjögren (80%)
• Lupus eritematoso sistemico (20%)
• Sclerosi sistemica (25%)
• Artrite psoriasica (10%)
• Polimiosite e dermatomiosite (10%)
• Malattie infiammatorie croniche intestinali
• Patologie infettive (parvovirus B19, HCV, EBV, infezioni batteriche croniche, infezioni parassitarie)
• Neoplasie
• Sarcoidosi (10%)
• Crioglobulinemia mista
• etc.

Il FR è presente anche in un 5% circa della popolazione sana e la percentuale aumenta notevolmente nella popolazione anziana.

I metodi storicamente impiegati per evidenziarli sono la reazione di Waaler-Rose e il RA-test. Attualmente il dosaggio del FR viene eseguito routinariamente con metodi nefelometrici standardizzati e automatizzati, in grado di rilevare, però, solo FR di classe IgM. Per la determinazione di FR di classe non IgM (IgG o IgA) viene utilizzata la metodica ELISA, in cui i campioni di siero in esame vengono incubati con IgG di coniglio immobilizzate su pozzetti di micropiastre.

Anticorpi organo-specifici

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