Papillomaviridae

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Alla famiglia Papillomaviridae appartengono oltre 200 genotipi di papillomavirus (precedentemente classificati nella famiglia dei Papoviridae insieme ai poliomavirus) ampiamente distribuiti nel regno animale; di questi papillomavirus, circa 150 infettano l’uomo (papillomavirus umani, HPV).

Gli HPV appartengono a 5 generi (α, β, γ, μ, ν), di cui i primi due sono i più importanti per la patologia umana. Ogni genere è suddiviso in specie e ogni specie in genotipi.

Gli HPV hanno uno spiccato tropismo per i tessuti epiteliali e, in base alla loro tessuto-specificità, possono essere distinti in:

• Cutanei (α, β, γ, μ, ν): infettano l’epitelio squamoso pluristratificato cheratinizzato della cute
• Mucosi (α): infettano l’epitelio squamoso pluristratificato non cheratinizzato (vagina, esocervice, canale anale, cavo orale, orofaringe, laringe)

Circa 40 genotipi infettano l’epitelio anogenitale; alcuni genotipi infettano in maniera specifica la mucosa del cavo orale e delle vie respiratorie superiori.

Dal 2017 è in commercio in Italia un vaccino 9-valente ricombinante, rivolto contro la proteina L1 di HPV 6, 11, 16, 18 e di altri 5 sierotipi oncogeni.

Gli HPV sono virus piccoli, con capside icosaedrico, privi di envelope (involucro pericapsidico) e con genoma costituito da una singola molecola di dsDNA circolare di circa 8 kb.

Il capside ha un diametro di ≈ 55 nm ed è costituito da due proteine strutturali (la proteina capsidica maggiore L1, comune a tutti gli HPV, e la proteina capsidica minore L2) che formano 72 capsomeri.

Il genoma codifica per 6 geni precoci (early: E1, E2, E4, E5, E6, E7) e 2 geni tardivi (late: L1 e L2).

Le proteine precoci, non strutturali, attivano la sintesi degli RNA virali, promuovono la replicazione virale (da parte della DNA polimerasi della cellula ospite) e sono coinvolte nella trasformazione cellulare:

• E1: ha attività elicasica e ATPasica e interagisce con la DNA polimerasi-primasi, permettendo la formazione del complesso di inizio della replicazione. E1 lega il sito di inizio della replicazione a bassa affinità: questo legame viene stabilizzato da E2.
• E2: regola la trascrizione virale, comportandosi da attivatore o repressore (in particolare, E2 reprime l’attività del promotore di E6/E7: la perdita di E2 è uno step fondamentale della trasformazione neoplastica) e si associa a E1, permettendo il legame ad alta affinità del sito di inizio della replicazione.
  E1 e E2 sono indispensabili per il mantenimento del DNA virale in forma episomale.
• E4: la sua funzione precisa non è nota; sembra contribuire alla liberazione della progenie virale matura e alla formazione del caratteristico alone citoplasmatico delle cellule infettate da HPV.
• E5: attiva il signaling intracellulare dell’EGF, promuovendo la proliferazione cellulare, e riduce l’espressione delle molecole MHC di classe I e II, favorendo l’elusione della risposta immunitaria dell’ospite.
• E6: inibisce la morte per apoptosi della cellula ospite inducendo la degradazione ubiquitina-dipendente della p53 e di altre proteine. È in grado quindi di immortalizzare e trasformare la cellula infettata. Può inoltre attivare la telomerasi, causando instabilità cromosomica e senescenza cellulare.
• E7: lega e inattiva proteine della famiglia Rb (inibendo l’arresto del ciclo cellulare) e interagisce con la istone-deacetilasi inducendo il rimodellamento della cromatina e l’ingresso della cellula in fase S. Il blocco del controllo del ciclo cellulare rende possibile la replicazione produttiva in cellule soprabasali differenziate.

Esistono anche una proteina E3 e, in alcuni genotipi di HPV, una proteina E8, entrambe con funzione sconosciuta.

Tra le regioni codificanti L ed E, si trova la regione non codificante LCR (Long Control Region), chiamata anche URR (Upstream Regulatory Region), che contiene elementi regolatori per la trascrizione e la replicazione virale e una sequenza enhancer che interagisce sia con prodotti genici virali, che con fattori cellulari (come Sp1, AP-1, NF-1, GRE, etc.).

Le proteine tardive L1 e L2 sono le proteine strutturali del capside.

Il contagio può avvenire per:

• Contatto diretto con cute e mucose genitali (dei 120 HPV identificati, circa 40 sono trasmessi prevalentemente per via sessuale: quella da HPV è l’infezione sessualmente trasmessa più diffusa al mondo)
• Contatto indiretto (strumentario medico, utensili o biancheria contaminati)
• Via verticale: dalla madre al figlio (durante la gravidanza o durante il parto)

È possibile anche l’autoinoculazione.

L’HPV infetta gli epiteli squamosi pluristratificati e il ciclo vitale dell’HPV è regolato dal differenziamento della cellula epiteliale infettata. Per poter stabilire un’infezione persistente, il virus deve raggiungere i cheratinociti dello strato basale, attraverso soluzioni di continuo superficiali. La replicazione virale, invece, si verifica nei cheratinociti ben differenziati degli strati spinoso e granuloso.

Il virus entra nella cellula per endocitosi, perde il suo involucro proteico e il genoma virale si stabilisce nel nucleo in forma episomale (non integrata).

Nelle cellule epiteliali indifferenziate dello strato basale, il promotore precoce (ad esempio P₉₇ di HPV31 e HPV16 e P₁₀₅ di HPV18) induce l’espressione dei geni precoci E1, E2, E6 e E7. Avviene quindi la replicazione virale cosiddetta “plasmidica” (in parallelo alla replicazione del DNA cellulare), responsabile dello stato latente dell’infezione.

Nel passaggio da infezione latente ad infezione produttiva entrano in gioco complesse interazioni tra ospite, virus e fattori ambientali, tra cui:

• Genotipo virale
• Stato di “permissività cellulare”
• Sistema immunitario dell’ospite
• Suscettibilità individuale

Nei cheratinociti differenziati, nei quali non si verifica più la replicazione del DNA cellulare, un incremento dei livelli di E1 e E2 promuove la replicazione virale “vegetativa”, con produzione di migliaia di copie di genoma virale in ogni cellula infetta. 
Nello strato granuloso, il promotore tardivo (ad esempio P₇₄₂ di HPV 31) induce l’espressione dei geni E4, L1 e L2 e l’assemblaggio delle particelle virali infettive mature, che vengono rilasciate dallo strato corneo con la desquamazione (senza lisi cellulare).

Manifestazione	Genotipi di HPV
Verruca volgare	1, 2, 4, 26, 27, 28, 29, etc.
Verruca del macellaio	2, 4, 7
Verruca piana	3, 10, 27, 38, 41, etc.
Verruca filiforme	2
Verruca plantare	1, 2
Epidermodisplasia verruciforme	5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, etc.
Condilomi acuminati	6, 11, 16, 18
Condiloma acuminato gigante	6, 11, 16, 18, 33
Papulosi bowenoide	16, 18, 31, 33, 39, 52, 55
Papilloma squamoso orale	6, 11, 16, 18
Papilloma congiuntivale	11
Papillomatosi laringea	6, 11
Iperplasia epiteliale focale di Heck	13, 32
Neoplasie intraepiteliali di basso grado	6, 11
Neoplasie intraepiteliali di alto grado	16, 18
Carcinomi	16, 18

Carcinogenesi da HPV

L’evento chiave della trasformazione maligna è il passaggio del genoma virale dallo stato episomale (non integrato) a quello integrato nel genoma della cellula ospite. L’integrazione provoca l’inattivazione di E2 e, quindi, la perdita di inibizione dei geni E6 ed E7, che nel complesso determinano:

• Promozione del ciclo cellulare (E7)
• Riduzione dell’apoptosi (E6)
• Instabilità genomica (E6, E7)
• Up-regulation della telomerasi (E6)

Nb. ⇒ L’espressione dell’oncoproteina E5 viene persa in caso di integrazione del genoma virale (ovvero nelle lesioni di alto grado e nei carcinomi); la sua funzione non è quindi necessaria per il mantenimento del fenotipo trasformato.

L’integrazione determina, oltre alla trascrizione incontrollata dei geni precoci E6 ed E7, un’interruzione del ciclo di crescita del virus e perdita della sua capacità replicativa: le proteine capsidiche non sono infatti rilevabili nelle lesioni di alto grado e nei carcinomi invasivi.

L’inibizione dell’arresto del ciclo cellulare in G1, della riparazione del DNA danneggiato e dell’apoptosi e l’instabilità genomica predispongono la cellula ospite all’accumulo di mutazioni.

In base al rischio oncogeno, la classificazione IARC 2011 distingue:

HPV16 e 18 sono responsabili da soli del 70% dei carcinomi cervicali. Il restante 30% è dovuto soprattutto a HPV 45, 31, 33, 58, 52 e 35.

Nei genotipi ad alto rischio, E7 non solo inattiva Rb, ma ne induce anche la degradazione ubiquitina-dipendente. Inoltre, inibisce p21 e p27 (due inibitori delle cicline-chinasi) e attiva direttamente le cicline A ed E.

L’infezione da HPV costituisce tuttavia solo l’evento iniziante: per la trasformazione maligna è necessaria l’acquisizione di altre mutazioni.

L’HPV non è coltivabile su linee cellulari, ma richiede colture organotropiche in grado di mimare la struttura dell’epidermide e il differenziamento dei cheratinociti. L’isolamento dell’HPV è quindi un esame molto complesso e costoso e non viene utilizzato a scopo diagnostico.

La sierologia non è utile: una risposta anticorpale è presente solo in una ridotta percentuale di soggetti, ha breve durata e il titolo anticorpale non si è dimostrato un marcatore affidabile per la diagnosi di infezione da HPV.

La replicazione dell’HPV determina un effetto citopatico chiamato “coilocitosi”, caratterizzato da vacuolizzazione delle cellule squamose, visibile come un ampio alone perinucleare chiaro.
I nuclei possono essere ipercromici, grandi e irregolari oppure piccoli e picnotici (le alterazioni nucleari associate ad alone perinucleare prendono il nome di atipia coilocitica).

L’infezione produttiva da HPV può quindi essere dimostrata indirettamente ricercando le alterazioni tipiche che induce a livello cellulare, tramite:

• Pap test / ThinPrep® (citologia in fase liquida)
• Biopsia (esame istologico)

Di particolare importanza sono le tecniche di biologia molecolare, in grado di evidenziare anche l’infezione latente. Possono essere eseguite su liquidi, su cellule o su tessuti. Ricercano la presenza di acidi nucleici (RNA o DNA) virali:

• HPV DNA test
• HPV E6/E7 mRNA test
• sequenziamento diretto
• etc.