Diagnostica dermatologica

Lampada di Wood

Erythrasma

Centers for Disease Control and Prevention / Dr. Lucille K. Georg, Public Health Image Library (https:// https://phil.cdc.gov/Details.aspx?pid=12638)

La lampada di Wood (black light) emette radiazioni di lunghezza d’onda comprese tra 320–450 nm, corrispondenti in parte ai raggi UVA e in parte allo spettro della luce visibile di colore viola-blu.

È una metodica semplice, rapida, indolore e non invasiva.

L’esame deve essere effettuato al buio e la lampada deve essere posta ad una distanza di circa 10-15 cm dalla cute.

La luce ultravioletta consente di evidenziare la presenza di sostanze fluorescenti, di ausilio nella diagnosi soprattutto di:

• Vitiligine (fluorescenza bianco avorio)
• Pitiriasi versicolor (fluorescenza giallo-oro)
• Tinea microsporica (fluorescenza verde)
• Eritrasma (fluorescenza rosa salmone o rosso corallo)

Tinea Capitis by Microsporum canis

Copyright © 2021 Yang et al. “Tinea Capitis by Microsporum canis in an Elderly Female with Extensive Dermatophyte Infection.” Mycopathologia (CC BY 4.0)

Vitiligo

Copyright © Chip Bobbert, CC BY-SA 4.0, via Wikimedia Commons

Ecografia cutanea

Ultrasound image of: (a) nevus; (b) basal cell carcinoma; (c) malignant melanoma.
The primary layers of the skin are marked by the red (epidermis) and green (dermis) marks on the sides of the images. The lesions are marked by a white letter ‘L’ placed above them on the images.

Copyright © 2021 Marosán-Vilimszky et al. “Automated Skin Lesion Classification on Ultrasound Images.” Diagnostics. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. (CC BY 4.0)

Microscopia laser confocale

Melanocytic Nevi
These lesions show typical network (A) and regular globules (D), on dermoscopy. RCM mosaic image (B, 1×1 mm) at the level of the dermoepidermal junction shows rings of bright polygonal cells surrounding roundish to oval dark areas corresponding to dermal papillae at dermoepidermal junction. RCM mosaic image (E, 1,5×1,5 mm) at the level of the dermoepidermal junction and dermis shows compact aggregates of large polygonal cells similar in morphologic features and reflectivity, forming polyhedral structures.

Copyright © 2013 Braga et al. “Learning reflectance confocal microscopy of melanocytic skin lesions through histopathologic transversal sections.” PloS one. CC BY

La microscopia laser confocale è una “biopsia ottica virtuale” che consente di visualizzare in vivo e in modo indolore e non invasivo sezioni orizzontali di cute, a differenti profondità, fino ad un massimo di 250 μm.
Alcuni strumenti sono dotati di supporti specifici per lo studio anche delle mucose orali, congiuntivali e genitali.

Il microscopio confocale utilizza come sorgente luminosa un laser a diodi che analizza l’area in esame un solo punto alla volta, fornendo delle immagini in bianco e nero con risoluzione elevata, quasi paragonabile a quella del preparato istologico.
L’utilizzo di più laser permette di acquisire immagini a colori.

La microscopia laser confocale consente quindi di evitare biopsie e asportazioni non necessarie, di fare diagnosi precoce e di stabilire con precisione i margini della lesione.

Le immagini digitali, inoltre, possono essere archiviate, confrontate ed inviate ad un centro di ricerca avanzato per analisi più approfondite.

La microscopia laser confocale può essere di ausilio nello studio di numerose condizioni dermatologiche:

• Melanoma: la microscopia confocale ha mostrato una sensibilità e una specificità superiori alla dermoscopia
• Carcinoma basocellulare
• Carcinoma squamocellulare
• Cheratosi attinica
• Altre neoplasie cutanee
• Malformazioni vascolari
• Dermatosi infiammatorie (es. psoriasi)
• Patologie del cuoio capelluto

(a) Reflectance confocal microscopy (RCM) image of a pigmented basal cell carcinoma (approximately 1.5 × 1.5 mm). At the level of superficial dermis we can see a bright tumor island (yellow rectangles), which resembles an elongated cord-like structures and that is well demarcated from surrounding dermis by cleft-like dark space (green star). Fine dendritic processes are visible within the tumor island with the typical peripheral palisading of nuclei (red arrow).
(b) RCM image of a basal cell carcinoma  (approximately 1.5 × 1 mm) at the superficial dermis level. Canalicular vessels are curved or linear structures very frequent in basal cell carcinomas with small bright cells inside which correspond to leukocytes (red arrow). Tumor islands (in the yellow rectangles) with many dendritic and plump-bright cells. Dendritic cells are melanocytes while plump-bright cells that are oval to stellate bright cells without apparent nucleus, correlate with melanophages (green star).
(c) RCM image of basal cell carcinoma (approximately 1.5 × 1 mm) at the superficial dermis level. It is possible to observe many dark silhouettes (yellow rectangles), which are tumor islands in nonpigmented basal cell carcinomas, surrounded by thickened collagen. On the right hand side there is a dark oval area which corresponds to an ulceration (red arrow).

Copyright © 2020 Fania et al. “Basal Cell Carcinoma: From Pathophysiology to Novel Therapeutic Approaches.” Biomedicines. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. (CC BY 4.0)

(a) Reflectance confocal microscopy (RCM) mosaic of a well differentiated cutaneous squamous cell carcinoma (8 × 8mm). Yellow arrow shows a scale crust and ulceration in the lower part of the figure. (b) Green rectangle: a magnification of an RCM image (1 × 1.5 mm) at the epidermal layer shows atypical honeycomb pattern, which is characterized by thickened and broadened keratinocytes outlines of varying size and shape. (c) Red rectangle: a magnification of an RCM mosaic (1 × 1.5 mm) at the dermoepidermal junction layer shows round or coiled vessels (red arrows) that run through the dermal papillae perpendicularly to the lesion surface. (d) Blue rectangle: a magnification of an RCM mosaic (1 × 1 mm) at the spinous-granular layer shows a disarranged pattern characterized by architectural disarray and the presence of dendritic (blue arrows) and plump bright cells which represent pigmented keratinocytes and melanocytes infiltrating the epidermis.

Copyright © 2021 Fania et al. “Cutaneous Squamous Cell Carcinoma: From Pathophysiology to Novel Therapeutic Approaches.” Biomedicines. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. (CC BY 4.0)

Superficial spreading melanoma
This lesion shows on dermoscopy (A) pseudopods (white circle corresponds to the punch area). Reflectance confocal microscopy (RCM) mosaic image (B, 3×3 mm) at the level of the dermoepidermal junction shows compact aggregates of atypical cells distributed in a linear arrangement toward the periphery with a dense nest at the extremity (the area inside the dashed square is represented in figure C). RCM individual image (C, 0,5×0,5 mm) at the level of the dermoepidermal junction shows a pseudopod in detail, characterized by elongated, dense and bright peripheral aggregate.

Copyright © 2013 Braga et al. “Learning reflectance confocal microscopy of melanocytic skin lesions through histopathologic transversal sections.” PloS one. CC BY

Superficial spreading melanoma in situ
This lesion shows on dermoscopy (A) a slightly pigmented network (white circle corresponds to the punch area). Reflectance confocal microscopy (RCM) mosaic image (B, 1×1 mm) at the level of the dermoepidermal junction shows irregular and dishomogeneous dermal papillae with dendritic cells (white arrows). RCM individual image (C, 0,5×0,5 mm) at the level of the dermoepidermal junction shows dendritic cells forming “bridges” called mitochondria-like structures (white arrow). Perpendicular section (D) shows disarrangement of the rete ridge and the increased number of atypical melanocytes. Transverse section (E, HE staining) shows atypical melanocytes protruding into the dermal papillae forming bridges (black arrows). Transverse section (F, Melan-A staining) shows cells positive for Melan-A protruding into the dermal papillae (white arrows).

Copyright © 2013 Braga et al. “Learning reflectance confocal microscopy of melanocytic skin lesions through histopathologic transversal sections.” PloS one. CC BY

A seconda del sospetto diagnostico, possono rendersi necessari alcuni tipi di esame, ad esempio:

• Citopatologia
• Istopatologia
• Istochimica
• Immunopatologia
• Ultrastrutturale
• Microbiologia
• Biologia molecolare

Il materiale da analizzare può essere prelevato mediante:

• Apposizione, con o senza l’aiuto di nastro adesivo trasparente (“Scotch test”), a seconda del tipo di lesione (vescicole, bolle, pustole, croste, erosioni, etc.)
• Scarificazione cutanea (con il vetrino portaoggetto o con la lama di un bisturi)
• Agoaspirato
• Punch biopsy
• Shave biopsy
• Biopsia incisionale (prelievo con il bisturi di un frammento della lesione)
• Biopsia escissionale (asportazione della lesione in toto con margini clinicamente indenni)

Copyright © 2019 Lei, Benson U W, and Tarl W Prow. “A review of microsampling techniques and their social impact.” Biomedical microdevices (CC BY 4.0)

Shave biopsy

Copyright © 2020 Bruna Laís Wedig and Fernando Eibs Cafrune. “Shave biopsy for differential diagnosis of lentigo maligna on the face and scalp: diagnostic approach”. Surgical & Cosmetic Dermatology, Rio de Janeiro. (CC BY 4.0)

La biopsia cutanea viene effettuata previa anestesia locale con lidocaina all’1%, con o senza adrenalina. Al termine del prelievo, può essere necessaria una sutura.

In caso di lesioni multiple monomorfe, viene preferita la sede dove il prelievo comporta minori problemi estetici.
Nelle patologie a polimorfismo evolutivo, è preferibile scegliere la lesione più recente.
Nelle patologie bollose è fondamentale la visualizzazione della lesione bollosa e della cute sana perilesionale.
Nelle lesioni ulcerative è importante soprattutto la zona di passaggio tra la cute ulcerata e la cute sana.
Nelle lesioni tumorali o infiltrative, il prelievo deve essere sufficientemente profondo, in modo che si possa esaminare l’ipoderma sottostante.

Idrossido di potassio

Esame citodiagnostico di Tzanck

Il test citodiagnostico di Tzanck è un esame rapido e a basso costo.

Si esegue strisciando su vetrino il materiale prelevato dal pavimento di vescicole, bolle o pustole oppure mediante scarificazione di lesioni solide.

Dopo aggiunta della colorazione (generalmente May-Grunwald-Giemsa o blu di toluidina), il vetrino viene esaminato al microscopio ottico.

L’esame rappresenta un ausilio fondamentale nella diagnosi di diverse condizioni, come:

• Herpes simplex, varicella, herpes zoster: degenerazione balloniforme e cellule giganti multinucleate con corpi inclusi intranucleari
• Mollusco contagioso: ampie inclusioni citoplasmatiche ovoidali omogenee contenenti particelle virali (corpi di Henderson-Paterson o del mollusco)
• Leishmaniosi cutanea: parassita in forma amastigote all’interno dei macrofagi o negli spazi extracellulari, sotto forma di corpuscoli rotondeggianti, di 2-4 µm, con grosso nucleo globoso e cinetoplasto piriforme o bastoncellare (corpi di Leishman-Donovan)
• Malattie bollose autoimmuni del gruppo del pemfigo: cellule acantolitiche
• Neoplasie cutanee: pleomorfismo cellulare, atipie nucleari, mitosi (es. cellule di dimensioni aumentate, pleomorfe, con citoplasma basofilo e nuclei grandi, pleomorfi, ipercromici, irregolari e/o multipli)

Herpes zoster: Tzanck smear from the base of the vesicle shows multinucleated giant cells (staining—Giemsa stain; magnification—40×)

Copyright © 2020 Sah et al. “Herpes zoster in an 11-month-old immunocompetent infant: A rare case report.” Clinical Case Reports published by John Wiley & Sons Ltd. (CC BY 4.0)

Paraneoplastic Pemphigus: acantholytic cells in Tzanck smear (arrows) (Giemsa, ×40).

Copyright © 2012 Mahajan et al. “Paraneoplastic pemphigus: a paraneoplastic autoimmune multiorgan syndrome or autoimmune multiorganopathy?.” Case reports in dermatological medicine. CC BY

Immunofluorescenza

Skin confocal immunofluorescence analysis

Copyright © 2021 Caporali et al. “Post Zygotic, Somatic, Deletion in KERATIN 1 V1 Domain Generates Structural Alteration of the K1/K10 Dimer, Producing a Monolateral Palmar Epidermolytic Nevus.” International journal of molecular sciences. (CC BY 4.0)

L’immunofluorescenza è una tecnica di microscopia che consente di valutare la presenza e la distribuzione di uno o più antigeni bersaglio sfruttando, da un lato, la reazione antigene-anticorpo e, dall’altro, il fenomeno della fluorescenza.

L’anticorpo che riconosce l’antigene oggetto di studio prende il nome di anticorpo primario.

Nell’immunofluorescenza diretta (IFD), l’anticorpo primario è direttamente coniugato al fluorocromo.
Questa metodica è rapida e mostra specificità elevata, ma presenta sensibilità più bassa rispetto all’immunofluorescenza indiretta e costi maggiori (sono necessari tanti anticorpi specifici legati a fluorocromi quanti sono i diversi bersagli antigenici da rilevare).

L’immunofluorescenza indiretta (IFI) utilizza due anticorpi: l’anticorpo primario, che lega l’antigene oggetto di studio, e l’anticorpo secondario, rivolto contro la regione costante dell’anticorpo primario e coniugato al tracciante fluorescente.
Rispetto all’immunofluorescenza diretta, presenta:

• Sensibilità maggiore e segnale amplificato (gli anticorpi secondari possono riconoscere più epitopi dell’anticorpo primario)
• Tempi di esecuzione più lunghi (sono necessarie due fasi di incubazione: una per il legame tra anticorpo primario e campione in esame e una per il legame tra anticorpo secondario e anticorpo primario)
• Possibilità di indagare contemporaneamente un numero elevato di antigeni
• Costi più contenuti (è sufficiente un solo tipo di anticorpo coniugato per indagare un’ampia gamma di epitopi)

Per ridurre al minimo la cross-reattività, gli anticorpi primari vengono prodotti in specie differenti rispetto a quella del campione in esame (es. coniglio, ratto, capra) e quelli secondari sono specie-specifici (anti-coniglio, anti-ratto, anti-capra).

Dopo un periodo di tempo sufficiente, il campione viene lavato ed esaminato al microscopio a fluorescenza o al microscopio confocale. La fluorescenza indica l’avvenuto legame antigene-anticorpo. La presenza (o assenza) della reazione e il pattern di fluorescenza possono indirizzare nella diagnosi.

L’immunofluorescenza consente la ricerca di microrganismi patogeni, anticorpi specifici, complessi antigene-anticorpo, strutture cellulari specifiche, markers tumorali, etc.

In ambito dermatologico, è utilizzata soprattutto nella diagnosi di dermatosi a patogenesi immuno-mediata:

• Malattie bollose autoimmuni del gruppo del pemfigo (pemfigo volgare, pemfigo foliaceo, etc.)
• Malattie bollose del gruppo del pemfigoide (pemfigoide bolloso, pemfigoide cicatriziale, herpes gestationis, etc.)
• Dermatite erpetiforme di Duhring
• Lupus eritematoso cutaneo e sistemico
• Sindrome di Sjögren
• Sclerosi sistemica
• Dermatomiosite

Un esempio: nel sospetto di malattia bollosa autoimmune, l’immunofluorescenza diretta viene eseguita sul prelievo bioptico di cute perilesionale utilizzando sieri animali che esprimono anticorpi contro immunoglobuline di classe G, M e A e frazioni C3 e C4 del complemento umani. L’immunofluorescenza indiretta utilizza invece il siero del paziente su diversi substrati specifici (es. esofago di scimmia, esofago di cavia, vescica di ratto).

Clinical and immunopathological characteristics in bullous pemphigoid (BP, left), pemphigus vulgaris (PV, middle), and epidermolysis bullosa acquisita (EBA, right).

Copyright © 2018 Witte, Zillikens and Schmidt. “Diagnosis of Autoimmune Blistering Diseases.” Frontiers in medicine (CC BY)